Investigation of supernumerary centrosomes accumulation and Caspase-2 activation in human cell lines

I centrosomi sono organelli cellulari a base di microtubuli, composti da due centrioli e dal materiale pericentriolare che li circonda. I centrosomi sono coinvolti nell'organizzazione dei microtubuli, nella formazione del fuso mitotico e nella ciliogenesi. I centrosomi soprannumerari sono dannosi per la fisiologia cellulare e attivano il PIDDosoma, un complesso multiproteico, composto da PIDD1, RAIDD e Caspasi-2, che funge da piattaforma per l'attivazione della caspasi stessa. Il sito preferenziale di proteolisi di Caspasi-2 è stato individuato tramite screening peptidico nella sequenza VDVAD. Nonostante ciò, quando attivata tramite il PIDDosoma, Caspasi-2 scinde il suo substrato di elezione MDM2 (regolatore negativo di p53) a livello della sequenza FDVPD. In questa tesi presento evidenze di attività VDVAD-asica in cellule apoptotiche prive di Caspasi-2, suggerendo che questo sito di taglio non sia specifico di Caspasi-2 quando la sua attivazione avviene tramite il PIDDosoma. Al fine di indagare se la modalità di attivazione della proteasi determina le sue specificità di substrato, ho eseguito esperimenti di complementazione di Caspasi-2 facendo uso di diversi mutanti che influenzano il suo processamento autoproteolitico. Inoltre, presento prove che Caspasi-2 esogena è in grado di assemblare il PIDDosoma e proteolizzare MDM2 ma quando i suoi siti chiave di autoproteolisi sono mutati non è rilevabile il taglio di MDM2. I centrosomi soprannumerari si accumulano anche in caso di sovraespressione di PLK4 (chinasi regolatrice della duplicazione dei centrioli). Immagini di immunofluorescenza di cellule che sovraesprimono PLK4 sono state acquisite seguendo la cinetica di accumulo dei centrioli nel tempo. Di conseguenza, l’ingente mole di dati generati ha reso necessario lo sviluppo di una procedura semiautomatica per la conta dei centrioli. Questa pipeline è stata generata utilizzando il programma di elaborazione e analisi di immagini ImageJ e il programma di segmentazione basato su deep learning MitoS, insieme al modello MitoSegNet, che è stato affinato per la conta dei centrioli evidenziati tramite immunofluorescenza diretta contro diversi epitopi centrosomiali, ossia: Centrin 1, γ-Tubulina e ANKRD26. Questo metodo semiautomatico di quantificazione dei centrioli è facile da usare, riproducibile e più veloce della quantificazione manuale. Utilizzando questa procedura per quantificare i centrioli nelle cellule prive di p53, SCLT1 o ANKRD26, dimostriamo che l'accumulo di centrosomi soprannumerari in queste cellule è simile a quello riscontrato nelle cellule parentali.

Centrosomes are microtubule-based organelles composed of two centrioles and peri-centriolar material, involved in the formation and organization of the mitotic spindle, serving as microtubule-organizing center and involved in ciliogenesis. Supernumerary centrosomes are detrimental for cell physiology and activate the PIDDosome, a multi-protein complex that serves as a platform for the activation of Caspase-2, composed of: PIDD1, RAIDD and Caspase-2 itself. Caspase-2’s preferred cleavage site based on peptide screening is VDVAD, however Caspase-2, when activated via the PIDDosome, cleaves its bona fide substrate MDM2 (negative p53 regulator) in the FDVPD sequence. Here, I present evidence for VDVADase activity in apoptotic cells lacking Caspase-2, which suggests that this cleavage site is not Caspase-2 specific when the Caspase-2 activation occurs via the PIDDosome. In order to investigate if the mode of activation of Caspase-2 determines its substrate specificities I performed a Caspase-2 rescue experiment and introduced several mutations affecting the Caspase-2 autoproteolytic-processing. Furthermore, I present evidence that exogenous Caspase-2 is able to form the PIDDosome and cleaves MDM2 but when key autoproteolytic sites are mutated no MDM2 cleavage is detectable. Supernumerary centrosomes also accumulate upon overexpression of PLK4 (a kinase regulator of the centriole duplication). Immunofluorescence images of cells overexpressing PLK4 were taken following the centrioles quantification over time. Consequently, a large amount of image data was accumulated, which necessitated the development of a semi-automated pipeline for centrioles counting. This pipeline was generated using the image processing and analysis tool ImageJ and the deep learning segmentation tool MitoS together with the pretrained MitoSegNet model, which was finetuned to count centrioles stained against different centrosomal epitopes, namely Centrin 1, γ-Tubulin and ANKRD26. This semi-automated method of centrioles quantification is easy to use, reproducible and faster than manual quantification. Using this pipeline to quantify centrioles in p53, SCLT1 or ANKRD26 lacking cells we demonstrate accumulation of supernumerary centrosomes in these cells similar to parental cells.